NEW YORK – Một nhóm nghiên cứu tại Đại học California, Santa Cruz (UCSC) đang phát triển một phương pháp sinh thiết lỏng RNA dựa trên công nghệ nanopore nhằm phát hiện ung thư giai đoạn sớm và khám phá các dấu ấn sinh học (biomarker). Cuối tháng trước, nhóm nghiên cứu do Daniel Kim, trợ lý giáo sư tại UCSC, dẫn dắt đã ký kết thỏa thuận hợp tác nghiên cứu với Oxford Nanopore Technologies. Theo đó, Oxford Nanopore sẽ hỗ trợ nhóm tiếp tục đánh giá phương pháp này thông qua một khoản tài trợ nghiên cứu có giá trị chưa được tiết lộ.
Công nghệ này có tên Locate-seq, sử dụng hệ thống PromethION 48 của Oxford Nanopore để giải trình tự RNA tự do trong máu (cell-free RNA – cfRNA) có chiều dài đầy đủ, sau khi chuyển đổi RNA thành cDNA. Phương pháp lần đầu tiên được mô tả trong một bản thảo tiền công bố (preprint) trên bioRxiv cách đây một năm, trong đó các nhà nghiên cứu đã áp dụng nó trên các mẫu của bệnh nhân ung thư thực quản, bệnh nhân mắc Barrett thực quản (Barrett’s esophagus – tình trạng tiền ung thư) và người khỏe mạnh.
Theo Daniel Kim, Oxford Nanopore sẽ hỗ trợ xác thực phương pháp này trên một nhóm bệnh nhân có quy mô lớn hơn, bao gồm các trường hợp Barrett thực quản và ung thư thực quản. Tuy nhiên, các chi tiết của nghiên cứu vẫn đang được hoàn thiện.
Theo Lakmal Jayasinghe, Giám đốc Khoa học (CSO) của Oxford Nanopore, sinh thiết lỏng RNA đang nổi lên như một hướng tiếp cận đầy hứa hẹn trong phát hiện ung thư giai đoạn sớm, với nhiều ưu điểm tiềm năng so với các phương pháp truyền thống dựa trên DNA.
“RNA ổn định hơn DNA trong môi trường không có tế bào, mang lại nhiều lợi thế nhờ cho phép phân tích các bản phiên mã có chiều dài đầy đủ và cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về sinh học so với chỉ phân tích các mảnh DNA bị phân cắt,” ông chia sẻ qua email.
Locate-seq được phát triển dựa trên các nghiên cứu trước đây của nhóm Daniel Kim về sinh thiết lỏng RNA. Năm 2023, nhóm đã giới thiệu Complete-seq, một phương pháp phân tích RNA tự do trong máu có nguồn gốc từ các vùng trình tự lặp của bộ gen, chẳng hạn như các yếu tố chuyển vị (transposable elements), ở bệnh nhân ung thư bằng cách kết hợp cả công nghệ giải trình tự của Illumina và nanopore. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể phân loại chính xác một số loại ung thư dựa trên sự hiện diện của các dấu hiệu RNA lặp đặc trưng, mặc dù chưa áp dụng được cho tất cả các loại ung thư.
Kim cho biết, do RNA có nguồn gốc từ các vùng lặp tạo ra rất ít tín hiệu trong các mẫu ung thư thực quản, ông bắt đầu đặt câu hỏi:
“Liệu còn thành phần nào khác trong transcriptome mà chúng ta có thể khai thác để phát hiện ung thư giai đoạn sớm với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao?”
Chính câu hỏi này đã trở thành động lực để nhóm phát triển Locate-seq.
Trong nghiên cứu thí điểm của Locate-seq, Kim cùng các đồng nghiệp tại UCSC và Rebecca Fitzgerald, giáo sư chuyên ngành phòng ngừa ung thư tại Đại học Cambridge, đã tách chiết cfRNA từ huyết tương của:
- 16 người khỏe mạnh;
- 12 bệnh nhân Barrett thực quản (tình trạng tiền ung thư);
- 19 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến thực quản.
Sau khi xây dựng thư viện cDNA, nhóm nghiên cứu đã phát hiện 276.346 bản phiên mã chưa từng được chú thích trong cơ sở dữ liệu GENCODE 39.
Một phát hiện đáng chú ý là RNA ty thể (mitochondrial RNA) xuất hiện với mức độ rất cao trong cfRNA của cả bệnh nhân Barrett thực quản và bệnh nhân ung thư thực quản. Theo Kim, đây là một tín hiệu rất mạnh nhưng cơ chế sinh học đứng sau hiện tượng này hiện vẫn chưa được hiểu rõ.
Kim cũng bất ngờ trước số lượng rất lớn các cfRNA mới được Locate-seq phát hiện. Theo Kin Fai Au, chuyên gia về giải trình tự đọc dài tại Trường Y Đại học Michigan, đây vừa là lý do để lạc quan, vừa là điều đáng cân nhắc.
Một mặt, con số 276.346 là rất lớn, đồng nghĩa với việc khả năng tìm được những biomarker có ý nghĩa sẽ cao hơn.
Tuy nhiên, ông cũng lo ngại rằng con số này lớn hơn đáng kể so với các nghiên cứu tương tự trước đây, có thể do quy trình lọc dữ liệu trong bản preprint chưa đủ nghiêm ngặt.
Dù vậy, Au ghi nhận rằng nhóm nghiên cứu đã sử dụng SQANTI3 – một công cụ tiêu chuẩn để kiểm soát chất lượng dữ liệu transcriptome – đồng thời đánh giá cao việc họ áp dụng chiến lược giải trình tự lai (hybrid sequencing strategy) nhằm định lượng các bản phiên mã mới bằng dữ liệu giải trình tự đọc ngắn.
Theo Au, nghiên cứu này là một minh chứng khái niệm (proof of concept) rất tốt. Khi được mở rộng trên số lượng bệnh nhân lớn hơn, nhóm nghiên cứu có thể xác định được một danh sách rút gọn (shortlist) các bản phiên mã chung ở những bệnh nhân mắc cùng một bệnh. Khi đó, việc phát triển các phương pháp giải trình tự đích (targeted sequencing), dù là đọc ngắn hay đọc dài, sẽ trở nên khả thi.
Au cũng cho rằng việc mở rộng quy mô nghiên cứu sẽ giúp tăng độ tin cậy của các mô hình học máy (machine learning) dùng để phân loại bệnh được mô tả trong bản preprint.
Các nhà nghiên cứu đã huấn luyện mô hình bằng cách sử dụng cả các bản phiên mã đã được chú thích trong GENCODE và các cfRNA mới được phát hiện. Khi chỉ sử dụng các bản phiên mã mới làm dữ liệu đầu vào, mô hình đạt độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 100% trong việc phân biệt cả tình trạng tiền ung thư và ung thư với nhóm khỏe mạnh.
Tuy nhiên, Au cho rằng kết quả này nhiều khả năng phản ánh hiện tượng overfitting, và việc sử dụng các bộ dữ liệu huấn luyện và kiểm định độc lập sẽ giúp giảm thiểu vấn đề này.
Phần lớn các bản phiên mã mới mà Locate-seq phát hiện đều có chiều dài dưới 1 kb.
Kim cho biết ông không lo ngại về khả năng của công nghệ Oxford Nanopore trong việc giải trình tự chính xác các bản phiên mã ngắn như vậy.
Tuy nhiên, Au lưu ý rằng 100–200 cặp base đầu tiên được đọc trên nền tảng nanopore thường có tín hiệu tương đối yếu. Ông cũng nhận xét rằng công nghệ HiFi của Pacific Biosciences hiện vẫn có độ chính xác nhỉnh hơn so với công nghệ nanopore.
Kim cho biết nhóm nghiên cứu lựa chọn Oxford Nanopore không chỉ vì UCSC là một trong những đơn vị tham gia phát triển công nghệ này, mà còn bởi trường có chuyên môn rất mạnh về nanopore.
Ngoài ra, mặc dù chưa nằm trong khuôn khổ hợp tác hiện tại với Oxford Nanopore, Kim hy vọng sẽ đánh giá khả năng triển khai sinh thiết lỏng bằng các hệ thống nhỏ hơn như PromethION 2 hoặc MinION, nhằm giúp năng lực phát hiện sớm ung thư không còn phụ thuộc vào việc phải tiếp cận các phòng thí nghiệm trung tâm lớn được trang bị hệ thống PromethION 48.
Một lợi thế tiềm năng khác của công nghệ Oxford Nanopore là khả năng đọc trực tiếp các thông tin biểu phiên mã (epitranscriptome) từ RNA. Theo Jayasinghe, đây có thể sẽ là hướng phát triển tiếp theo của sự hợp tác giữa hai bên.
Ông cho biết:
“Điều khiến sự hợp tác này trở nên đặc biệt là khả năng giải trình tự các bản phiên mã hoàn chỉnh hiện nay thông qua cDNA, đồng thời từng bước tiến tới các phương pháp giải trình tự RNA trực tiếp, cho phép bảo tồn các biến đổi tự nhiên của phân tử RNA.”