Trước đây việc chỉnh sửa gen được thực hiện bằng tích hợp ngẫu nhiên plasmid, transposon, virus hoặc thông qua tái tổ hợp tương đồng. Các phương pháp sau này nhằm tích hợp vào vị trí đặc hiệu, nhưng rất tốn thời gian và không hiệu quả. Với sự ra đời của các công cụ chỉnh sửa gen, việc chỉnh sửa một cách ổn định tại vị trí đặc hiệu giờ đây có thể được thực hiện dễ dàng. Bài viết giới thiệu một số nội dung cơ bản của các phương pháp chỉnh sửa gen (genome editing), hiệu quả sử dụng ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 kết hợp với công nghệ Nucleofector™ đã được đăng tải trên Tạp chí Resource Note số tháng 3.2016.

Hệ thống chỉnh sửa gen ZFN và TALEN

Hệ thống chỉnh sửa gen ZFN là thế hệ đầu tiên sử dụng protein khảm gồm vùng gắn ADN đặc hiệu cao ZF và vùng chức năng gắn với enzym cắt giới hạn Fokl. Hệ thống ZFN được áp dụng thành công trong việc chỉnh sửa hệ gen thực vật, cá ngựa vằn, chuột và các dòng tế bào người. Đặc biệt là thành công trong việc điều trị cho hơn 70 bệnh nhân nhiễm HIV và kết quả khả quan trong điều trị bệnh hồng cầu hình liềm.

            TALEN là thế hệ thứ hai linh hoạt hơn, chi phí thấp hơn, nhanh hơn và tốt hơn ZFN. TALEN gồm protein gắn ADN đặc hiệu TALEN và vùng chức năng để gắn với enzym cắt giới hạn Fokl. Hệ thống chỉnh sửa gen TALEN đã được áp dụng thành công để sửa đổi gen thực vật, côn trùng, giun tròn, cá, lưỡng cư, chuột, thỏ, tế bào ung thư người và tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng. Thành quả to lớn mới đây của TALEN đạt được khi áp dụng thành công trên bệnh nhân ung thư máu đầu tiên. Bằng cách chỉnh sửa tế bào T của người cho trước khi truyền vào bệnh nhân nhằm ngăn chặn khả năng tế bào T này tấn công bệnh nhân.

Hai hệ thống chỉnh sửa gen ZFN và TALEN có tiềm năng to lớn nhưng bên cạnh đó cũng có những hạn chế nhất định như: việc nhận diện trình tự đặc hiệu chịu trách nhiệm bởi vùng protein gắn ADN thông qua tương tác protein – ADN. Tương tác này không đặc hiệu hoàn toàn, hơn nữa khó dự đoán trước độ đặc hiệu mà cần phải kiểm tra và tối ưu hóa qua thực nghiệm; việc thiết kế ZFN và TALEN khó khăn do tính phức tạp trong thiết kế protein và dự đoán độ đặc hiệu. Ngoài ra, 2 phương pháp này còn có khả năng gây đột biến chệch mục tiêu và phát sinh độc tố.

Hệ thống CRISPR/Cas9 – một lựa chọn mới đầy tiềm năng

CRISPR được phát hiện vào năm 1987 trong vi khuẩn E. coli. Sự ra đời của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã khắc phục được những hạn chế của ZFN và TALEN, tạo nên cuộc cách mạng đột phá trong công nghệ sinh học.

Về bản chất, CRISPR là một phần hệ thống miễn dịch của vi khuẩn chống lại virus xâm nhiễm. Hệ thống này đã được ứng dụng trên các tế bào nhân thực. Tính đặc hiệu được điều khiển bởi “guide ARN” (thường gắn với một đoạn trình tự 18-20 cặp base trên ADN mục tiêu) và có thêm một số motifs giúp hình thành một phức hợp với Cas9 nuclease (CRISPR – associated nuclease). Để có thể gắn thành công Cas9, trong trình tự bộ gen đích phải có một đoạn trình tự protospacer adjacent motif (PAM) ngay sau trình tự đích. PAM là một motif NGG liền kề vị trí liên kết. Đối lập với ZFN và TALEN, hệ thống CRISPR giúp nuclease (enzyme cắt – Cas9) nhận biết trình tự cắt thông qua “guide ARN”. Đặc tính này giúp ta dễ dàng thiết kế một “guide ARN” mới khi cần cắt một trình tự mục tiêu mới và cũng cho phép cắt nhiều mục tiêu cùng lúc (khi kết hợp nhiều “guide ARN”).

Sự khác nhau giữa CRISPR/Cas9 với  ZFNs, TALENs

Một cách ngắn gọn, ZFN và TALEN cần phải tổng hợp protein, do đó tốn thời gian, công sức hơn để tạo ra một nuclease mới cho một vị trí mục tiêu khác. Đối với hệ thống CRISPR, chỉ cần tạo ra một “guide ARN” mới để gắn vào trình tự mục tiêu khác. Hơn nữa, với CRISPR việc gắn đa mục tiêu có thể được thực hiện bằng cách kết hợp Cas9 nuclease với nhiều “guide ARN” cùng lúc.

Tuy nhiên, hiện nay, phương pháp ZFN và TALEN có tính đặc hiệu cao hơn so với CRISPR và do đó rủi ro gắn không đúng trình tự đích sẽ thấp hơn. Nguyên nhân đầu tiên là do các phương pháp kia nhận biết trình tự ADN dài hơn và cần phải có 2 phân tử protein kết hợp với nhau mới tạo thành nuclease có hoạt tính (dạng dimer). Để khắc phục điều này, một vài nhà nghiên cứu đã biến đổi CRISPR/Cas9 nuclease thành một “nickase” có thể được sử dụng cùng với các cặp gARNs sense và antisense, do đó giúp tăng cường độ đặc hiệu.

Ưu thế của công nghệ chỉnh sửa gen Nucleofector™

Một đặc điểm chung của các phương pháp ZFN, TALEN hoặc CRISPR/Cas9 là để chỉnh sửa gen thành công cần phải chuyển đồng thời với nhiều vật liệu (plasmid, mARNs hoặc oligonucleotide) vào loại tế bào quan tâm (hình 1). Việc biến nạp đồng thời khó thực hiện đối với một số dòng tế bào như: primary T, tế bào gốc phôi người (hESCs) hoặc các tế bào gốc đa năng (iPSCs). Khó khăn này sẽ được giải quyết bằng công nghệ Nucleofector™.

Áp dụng công nghệ Nucleofector™ cho việc chỉnh sửa gen

Lonza cung cấp các protocol đã được tối ưu, sẵn sàng sử dụng cho rất nhiều loại tế bào (tham khảo www.lonza.com/protocols) bao gồm cả các dòng tế bào khó biến nạp. Trước khi thực hiện chỉnh sửa gen, chúng ta được khuyến nghị nên sử dụng vector đối chứng dương pmaxGFP™ để xác minh các điều kiện tối ưu mà Lonza đã xác định trong điều kiện người sử dụng thiết lập riêng.

Nếu không có sẵn protocol cho một loại tế bào nào đó, ta có thể dễ dàng xác định các điều kiện tối ưu cho nucleofection khi sử dụng vector pmaxGFP™ và làm theo protocol tối ưu hóa cho một nhóm tế bào nhất định hoặc các protocol tối ưu hóa chung của Lonza cho các primary cells hoặc cell lines. Ví dụ, đối với các ESCs hoặc iPSCs, chúng ta được khuyến nghị nên sử dụng Basic Stem Cell Protocol của Lonza vì mỗi dòng tế bào này có thể yêu cầu các điều kiện biến nạp đặc hiệu khác nhau. Khi đã xác định được các điều kiện tối ưu, thì áp dụng được cho biến nạp ADN hoặc ARN (hoặc cả hai). Để chỉnh sửa gen thành công, điều quan trọng là xác định hàm lượng vật liệu tối ưu. Điều này có thể khác nhau đối với các công cụ, loại vật liệu hoặc tế bào khác nhau (tham khảo thêm tại www.lonza.com/genome-editing).

Công nghệ Nucleofector™ còn phù hợp để chuyển các peptide và protein. Để bắt đầu, chúng ta được khuyến nghị nên sử dụng các điều kiện tối ưu đã được thiết lập cho axit nucleic, nhưng có thể cần đến một số chương trình tinh chỉnh. Các nghiên cứu gần đây đã chuyển Cas9-gARN ribonucleoprotein sử dụng hệ thống 4D-Nucleofector™ bằng cách biến nạp vào các loại tế bào khác nhau sử dụng Cas9 protein được trộn trước với gARN (tổng hợp trong phòng thí nghiệm).

Chọn lọc các dòng tế bào sau biến nạp và phân tích các sự kiện chỉnh sửa gen bằng công nghệ Nucleofector™

Chọn lọc dòng tế bào có thể được bắt đầu từ 24 giờ đến 7 ngày sau khi biến nap. Thời điểm tối ưu phải được dựa trên việc thiết lập thí nghiệm như thế nào. Một cách để tăng số lượng các dòng tế bào được biến nạp là đồng biểu hiện một protein phát huỳnh quang (cho phép làm giàu các tế bào được biến nạp bằng phương pháp phân loại FACS). Đối với các tế bào mà không được phát triển như các tế bào đơn (ESCs và iPSCs), phương pháp tách bằng FACS có thể thay thế cho quá trình pha loãng.

Chỉnh sửa gen có thể được phân tích bằng các phương pháp khác nhau. Các phương pháp thông thường được sử dụng bao gồm PCR hay RT-PCR, giải trình tự  như: giải trình tự sâu (deep sequencing), giải trình tự thế hệ mới (next generation sequencing), lai Southern blot, Northern blot hoặc các xét nghiệm tần số đột biến hoặc Western blot để phân tích protein knockout. Đối với iPSCs, Yang và cộng sự đã phát triển một hệ thống hiệu suất cao và dễ sử dụng (hệ thống đánh giá gen chỉnh sửa) bằng việc sử dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc cho cả HDR và NHEJ.