Giới thiệu

Vi khuẩn Mycoplasma đặc biệt khó phát hiện do kích thước cực nhỏ và thiếu thành tế bào. Để quan sát được chúng bằng kính hiển vi tiêu chuẩn, cần độ phóng đại lớn tới 1000X. Do đó, hình thái vô định hình của chúng thường dẫn đến việc bị nhận nhầm là mảnh vụn, túi ngoại bào hoặc các hạt virus.

Việc xác nhận hiệu quả của các chiến lược phòng ngừa đòi hỏi các phương pháp phát hiện chính xác. Tài liệu này sẽ tìm hiểu các phương pháp khác nhau bao gồm: nuôi cấy, khuếch đại DNA và phát hiện enzyme.

Các phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy truyền thống

Phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa trên việc nuôi mycoplasma trong môi trường đặc biệt, cho phép mycoplasma phát triển đồng thời ức chế các vi sinh vật khác. Mẫu từ nuôi cấy tế bào được ủ trong vài tuần để đánh giá sự hình thành khuẩn lạc.

Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thường được xem là “tiêu chuẩn vàng” và được yêu cầu trong các hướng dẫn quản lý đối với sản phẩm lâm sàng. Ngoài ra, nó còn cho phép đánh giá khả năng sống của mycoplasma.

Tuy nhiên, nhược điểm lớn là thời gian kéo dài (có thể lên đến 4 tuần), quy trình phức tạp và một số loài mycoplasma phát triển kém trong điều kiện nuôi cấy, dẫn đến nguy cơ âm tính giả.

Nuôi cấy tế bào chỉ thị

Phương pháp này tăng cường khả năng phát hiện bằng cách đồng nuôi cấy mẫu thử với các dòng tế bào chỉ thị như VERO hoặc 3T3. Sau thời gian ủ, DNA của mycoplasma trong các mẫu phụ được nhuộm huỳnh quang; các kiểu huỳnh quang đặc trưng cho thấy sự hiện diện của mycoplasma.

Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các mẫu thể tích nhỏ hoặc khó xử lý bằng các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic trực tiếp, dù quy trình phức tạp hơn so với các phương pháp nhanh.

Các xét nghiệm nhanh

Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic (NATs)

Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (NATs), bao gồm Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR), PCR phiên mã ngược (RT-PCR), PCR định lượng (qPCR) và Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP), đã cách mạng hóa việc phát hiện mycoplasma. Các phương pháp này hoạt động bằng cách khuếch đại các trình tự DNA hoặc RNA cụ thể, sử dụng các mồi đặc hiệu trình tự để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao. PCR đã trở thành một tiêu chuẩn nhờ khả năng phát hiện chỉ một sinh vật mycoplasma duy nhất.

Nhiều chiến lược PCR được áp dụng để phát hiện nhiễm mycoplasma trong nuôi cấy tế bào. Các kỹ thuật PCR một bước và hai bước (nested PCR) được sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA với độ chính xác cao, điều này rất quan trọng để phát hiện các mức độ nhiễm thấp. PCR đặc hiệu chi và loài nhắm vào các chủng mycoplasma phổ biến để đảm bảo khả năng bao phủ toàn diện. PCR thời gian thực (Real-time PCR) cung cấp kết quả định lượng, giúp tăng cường độ chính xác và độ tin cậy. RT-PCR giúp nâng cao hơn nữa độ nhạy bằng cách nhắm mục tiêu vào RNA ribosome (rRNA), vốn dồi dào hơn DNA, làm cho phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong việc xác định các tình trạng nhiễm trùng đang hoạt động. Các chiến lược PCR cần từ 1,5 đến 3 giờ để hoàn thành.

Một phương pháp khuếch đại DNA độc đáo là LAMP. LAMP khuếch đại DNA ở nhiệt độ không đổi (thường từ 60-65°C). Điều này đạt được bằng cách sử dụng một DNA polymerase có hoạt tính thay thế sợi và nhiều mồi nhận diện sáu vùng riêng biệt trên DNA mục tiêu. Bản chất đẳng nhiệt của LAMP giúp đơn giản hóa các yêu cầu về thiết bị, loại bỏ nhu cầu về máy chu trình nhiệt và cho phép khuếch đại nhanh chóng. LAMP có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời có thể cung cấp kết quả trong chưa đầy một giờ, khiến nó trở thành một lựa chọn tuyệt vời để phát hiện mycoplasma nhanh chóng và đáng tin cậy.

Một nhược điểm chính của các xét nghiệm LAMP so màu trong phát hiện mycoplasma là khó khăn trong việc kết hợp một đối chứng khuếch đại nội bộ đáng tin cậy. Không giống như PCR, vốn thường xuyên bao gồm các đối chứng nội bộ để xác nhận phản ứng thành công, LAMP so màu thường chỉ cung cấp một kết quả đọc duy nhất, gây khó khăn cho việc phân biệt giữa âm tính thật và âm tính giả. Các định dạng LAMP khác, chẳng hạn như xét nghiệm dòng chảy bên (lateral flow) hoặc dựa trên huỳnh quang, có thể hỗ trợ các đối chứng nội bộ hiệu quả hơn.

Các phương pháp khuếch đại DNA nhanh rất được coi trọng nhờ thời gian cho kết quả ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp chúng phù hợp cho việc ra quyết định kịp thời trong quá trình kiểm soát nhiễm bẩn. Tuy nhiên, một số phương pháp khuếch đại DNA yêu cầu thiết bị chuyên dụng. Hơn nữa, các xét nghiệm NATs có thể phát hiện DNA từ cả sinh vật sống và sinh vật đã chết, điều này có thể không phản ánh chính xác mức độ nhiễm bẩn hoặc rủi ro thực tế.

Phát hiện bằng enzyme

Xét nghiệm mycoplasma bằng enzyme cung cấp một giải pháp thay thế quan trọng cho các phương pháp nuôi cấy truyền thống và khuếch đại axit nucleic. Mycoplasma có các con đường chuyển hóa độc đáo, thiếu chu trình tricarboxylic và cytochromes, thay vào đó chúng dựa trên các con đường lên men arginine và carbohydrate để sản xuất ATP, ngoại trừ ureaplasmas, nơi việc sản xuất ATP phụ thuộc vào quá trình thủy phân urea.

Các xét nghiệm enzyme phát hiện các enzyme cụ thể, chẳng hạn như acetate kinase và carbamate kinase, những chất chuyển đổi ADP thành ATP khi có mặt các cơ chất cụ thể, tạo ra tín hiệu phát quang cho biết sự hiện diện của mycoplasma. Phương pháp này có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và nhanh chóng, cho kết quả trong khoảng 30 phút. Không giống như PCR có thể phát hiện DNA từ cả sinh vật sống và chết, phương pháp phát hiện bằng enzyme xác định các mycoplasma còn khả năng sống và hoạt động về mặt enzyme, giúp nó đặc biệt hữu ích trong quá trình điều trị bằng kháng sinh.

Bất chấp những ưu điểm, phương pháp phát hiện bằng enzyme vẫn có những hạn chế. Nó có thể tạo ra kết quả âm tính giả nếu nồng độ enzyme không đủ để phát hiện và không thể xác định một số loài mycoplasma nhất định, đặc biệt là ureaplasmas. Hiệu suất của phương pháp này trong các mẫu đã qua xử lý kháng sinh (có thể có mức độ mycoplasma dư thừa thấp) là kém khả quan hơn. Điều này nhấn mạnh nhu cầu cần có các phương pháp bổ sung để xác nhận việc loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong những trường hợp như vậy. Tuy nhiên, phát hiện bằng enzyme vẫn là một phương pháp cạnh tranh, tiết kiệm chi phí và nhanh chóng để phát hiện mycoplasma định kỳ trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt có lợi cho việc sàng lọc quy mô lớn và các phân tích hồi cứu.

Kết luận

Việc phát hiện và quản lý nhiễm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào là một khía cạnh then chốt để duy trì tính toàn vẹn của nghiên cứu và sự an toàn của sản phẩm. Do những thách thức từ đặc tính khó nắm bắt của Mycoplasma và những hạn chế của các phương pháp phát hiện khác nhau, một cách tiếp cận toàn diện là điều cần thiết. Hướng dẫn này đã chi tiết hóa những ưu điểm và nhược điểm của một số kỹ thuật phát hiện, bao gồm các phương pháp nuôi cấy, khuếch đại DNA và phát hiện bằng enzyme, đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc lựa chọn phương pháp phù hợp dựa trên các nhu cầu và ngữ cảnh cụ thể.

Một cách tiếp cận chủ động và có hiểu biết trong việc phát hiện và quản lý Mycoplasma không chỉ nâng cao độ tin cậy của các kết quả khoa học mà còn hỗ trợ sự tiến bộ của các ứng dụng công nghệ sinh học an toàn và hiệu quả.