Hiện tượng thu hồi nội độc tố thấp (Low-Endotoxin Recovery – LER) đã nổi lên như một vấn đề quan trọng liên quan đến phân tích và an toàn bệnh nhân trong ngành dược sinh học. Kiểm tra nội độc tố (endotoxin) là yêu cầu bắt buộc theo quy định đối với các sản phẩm dùng đường tiêm và cấy ghép; việc không phát hiện chính xác nội độc tố có thể dẫn đến việc lưu hành các sản phẩm có nguy cơ gây phản ứng sinh sốt (pyrogen) đáng kể về mặt lâm sàng [1,2].

Trong hơn một thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng một số công thức dược sinh học có thể làm giảm dần hoạt tính nội độc tố có thể phát hiện được theo thời gian, mặc dù nội độc tố vẫn còn hoạt tính sinh học. Hiện tượng này được gọi là low-endotoxin recovery (LER) và đặt ra thách thức đối với các giả định truyền thống của phép thử Bacterial Endotoxins Test (BET), đòi hỏi sự hiểu biết sâu hơn về cơ chế, đánh giá rủi ro và các chiến lược kiểm soát phù hợp [3,4].

Thu hồi nội độc tố thấp (LER) là gì?

Thu hồi nội độc tố được định nghĩa là hiện tượng che khuất hoặc bất hoạt dần khả năng phát hiện hoạt tính nội độc tố trong mẫu, dẫn đến tỷ lệ thu hồi endotoxin chuẩn được spike vào mẫu thấp hơn 50% giá trị kỳ vọng [4,5].

Mặc dù vẫn tồn tại tranh luận về sự khác biệt giữa nhiễu phương pháp (assay interference) cổ điển và LER, một đặc điểm phân biệt quan trọng là tính phụ thuộc vào thời gian. Nhiễu phương pháp thông thường xảy ra ngay lập tức và ổn định, và thường có thể khắc phục bằng cách pha loãng mẫu. Ngược lại, LER phát triển dần theo thời gian cho đến khi đạt trạng thái cân bằng ổn định. Đặc tính phụ thuộc thời gian này là yếu tố then chốt trong việc nhận diện cũng như hiểu rõ cơ chế của LER [3,6].

Cần lưu ý rằng LER không nhất thiết hàm ý nội độc tố bị phá hủy hoặc loại bỏ khỏi mẫu. Thay vào đó, hiện tượng này phản ánh sự suy giảm hoạt tính nội độc tố có thể đo được so với chuẩn tham chiếu, thường là Control Standard Endotoxin (CSE), trong các phép thử nội độc tố [4,7].

Vì sao hiện tượng thu hồi nội độc tố thấp xảy ra?

Nội độc tố, hay lipopolysaccharide (LPS), là một phân tử lưỡng tính (amphipathic) gồm:

• phần lipid A kỵ nước
• vùng polysaccharide ưa nước

Đặc tính này mang lại cho nội độc tố các tính chất tương tự chất hoạt động bề mặt, cho phép các phân tử nội độc tố tự liên kết thành các cấu trúc siêu phân tử đồng nhất (homo-supramolecular structures) như:

• micelle
• túi màng (vesicle)
• các dạng tập hợp (aggregates)

Tổ chức cấu trúc của các tập hợp này rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường, bao gồm:

• pH
• nhiệt độ
• lực ion của dung dịch
• sự hiện diện của các cation hóa trị hai như calci (Ca²⁺) và magnesi (Mg²⁺) [7–9].

Ái lực của nội độc tố đối với các thành phần trong dược chất hoặc ma trận công thức cũng có thể dẫn đến LER. Hiện tượng này ban đầu được ghi nhận trong các công thức chứa protein, khi nội độc tố được spike vào mẫu liên kết mạnh với protein điều trị, dẫn đến tỷ lệ thu hồi thấp hơn 50% [4].

Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy LER có thể xảy ra ở nhiều loại dược phẩm sinh học khác nhau, bao gồm:

• kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies)
• vắc-xin
• liệu pháp tế bào và liệu pháp gen
• công thức dựa trên lipid
• sản phẩm acid nucleic [3,5].

Các thành phần của ma trận được cho là có thể gây che khuất nội độc tố gồm:

• protein
• chất hoạt động bề mặt (surfactants)
• chất tạo phức kim loại (chelating agents)
• lipid
• các tá dược dùng để ổn định chế phẩm [3,5–6,9].

Một yếu tố quan trọng là hoạt lực sinh học của nội độc tố phụ thuộc chặt chẽ vào trạng thái kết tụ (aggregation state). Vì tất cả các phép thử nội độc tố được chấp thuận theo quy định đo hoạt tính sinh học thay vì nồng độ khối lượng, nên sự thay đổi cấu dạng hoặc trạng thái kết tụ của nội độc tố có thể dẫn đến giảm đáp ứng của phép thử, mặc dù tải lượng nội độc tố thực tế trong mẫu không giảm [7].

Có phải mọi sản phẩm và mẫu đều dễ xảy ra LER?

Không phải tất cả các mẫu đều dễ xảy ra hiện tượng này.

Các mẫu nước, bao gồm:

• nước pha tiêm (Water for Injection – WFI)
• nước tinh khiết
• nước dùng cho thẩm tách

thường không biểu hiện hiện tượng thu hồi nội độc tố thấp.

Điều tương tự cũng đúng với nhiều thuốc phân tử nhỏ có công thức tương đối đơn giản.

Tuy nhiên, khi độ phức tạp và khối lượng phân tử của các thành phần trong mẫu tăng lên, khả năng xảy ra tương tác giữa nội độc tố và các thành phần của mẫu cũng tăng theo. Do đó, các chế phẩm sinh học đại phân tử phức tạp như:

• protein điều trị
• sản phẩm acid nucleic
• liệu pháp tế bào

được ghi nhận là dễ xảy ra LER.

Ngoài ra, trong quy trình sản xuất sinh học nhiều công đoạn, mỗi bước của quá trình sản xuất có thể tạo ra một kịch bản LER mới, làm cho việc kiểm soát hiện tượng này trở nên phức tạp hơn.

LER chỉ xảy ra với các sản phẩm tiêm?

Mặc dù nguy cơ chính tập trung ở các chế phẩm sinh học phức tạp dùng đường tiêm và các sản phẩm liệu pháp tế bào, LER vẫn có thể ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra nội độc tố của các loại sản phẩm khác.

Năm 2023, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã gửi thư cảnh báo tới một nhà sản xuất lớn các thiết bị y tế dựa trên collagen dùng trong:

• chăm sóc vết thương
• sửa chữa mô mềm
• phẫu thuật tái tạo

FDA phát hiện rằng:

• quy trình thẩm định phương pháp kiểm tra nội độc tố còn yếu,
• và có lo ngại rằng LER đang ảnh hưởng đến các mức nội độc tố được báo cáo.

Vấn đề này đã dẫn đến một đợt thu hồi sản phẩm trên diện rộng [10].

Làm thế nào để phát hiện hiện tượng thu hồi nội độc tố thấp?

Phương pháp đáng tin cậy nhất để xác định LER là thực hiện nghiên cứu thời gian lưu mẫu (endotoxin hold-time study).

Trong nghiên cứu này:

1. Một lượng nội độc tố đã biết được spike vào ma trận sản phẩm.
2. Mẫu được kiểm tra ngay lập tức.
3. Sau đó tiến hành phân tích lặp lại tại các thời điểm xác định theo thời gian.

Nếu tỷ lệ thu hồi endotoxin spike giảm dần xuống dưới 50%, điều này cho thấy có hiện tượng LER [4,5].

Các nghiên cứu hold-time có thể cần kéo dài nhiều ngày hoặc thậm chí nhiều tuần để đặc trưng đầy đủ động học che khuất nội độc tố, vì một số công thức biểu hiện LER khởi phát chậm [3].

Ngoài ra, LER có tính phụ thuộc nhiệt độ rõ rệt:

• nhiệt độ cao thường làm tăng tốc quá trình che khuất nội độc tố
• nhiệt độ thấp làm chậm quá trình này

Do đó, khuyến nghị rằng các nghiên cứu hold-time nên được thực hiện ở:

• nhiệt độ phòng
• 2–8°C

Hiện nay, các nghiên cứu này ngày càng được xem là thành phần quan trọng trong đánh giá tính phù hợp của phương pháp (method suitability), đặc biệt đối với các chế phẩm sinh học phức tạp.

Các giao thức nghiên cứu hòa hợp do các hiệp hội ngành phát triển, chẳng hạn như:

• BioPhorum Operations Group (BPOG) – giao thức nghiên cứu LER hòa hợp
• Parenteral Drug Association (PDA) Technical Report No. 82 về LER

đã giúp cải thiện tính nhất quán trong đánh giá hiện tượng này. Ngoài ra, các tài liệu hỏi đáp từ Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) cũng đưa ra các kỳ vọng chung đối với thiết kế và báo cáo nghiên cứu LER, mặc dù việc diễn giải kết quả và đánh giá rủi ro vẫn cần được thực hiện riêng cho từng công thức sản phẩm.

Ý nghĩa đối với quy định và an toàn bệnh nhân

Rủi ro chính liên quan đến LER là khả năng vô tình đưa ra thị trường các chế phẩm sinh học có mức nội độc tố cao hơn so với kết quả được chỉ ra bởi các phép thử thường quy.

Do nội độc tố có thể vẫn duy trì hoạt tính sinh học mặc dù bị che khuất khỏi phép phát hiện, bệnh nhân có thể bị phơi nhiễm với liều nội độc tố gây sinh sốt, có khả năng gây ra:

• sốt
• phản ứng viêm
• tụt huyết áp
• trong trường hợp nghiêm trọng, phản ứng giống sốc nhiễm khuẩn [2,8].

Các cơ quan quản lý, bao gồm FDA, đã công nhận LER là một vấn đề đáng quan ngại và nhấn mạnh sự cần thiết của:

• thẩm định phương pháp phân tích một cách chặt chẽ
• các biện pháp kiểm soát dựa trên đánh giá rủi ro [2].

Kể từ khi LER được nhận diện vào năm 2013, FDA thường từ chối phê duyệt hồ sơ Biologics License Application (BLA) nếu nhà phát triển không cung cấp dữ liệu nghiên cứu hold-time chứng minh rằng nội độc tố vẫn có thể được phát hiện trong sản phẩm theo thời gian.

Do đó, việc hiểu rõ và kiểm soát LER không chỉ là vấn đề phân tích, mà còn là yếu tố cốt lõi trong đảm bảo chất lượng sản phẩm và an toàn bệnh nhân.

Nên làm gì?

Việc đánh giá thấp mức nội độc tố hoặc cho kết quả âm tính giả có thể gây hậu quả nghiêm trọng đối với cả bệnh nhân và nhà sản xuất dược phẩm.

Vì vậy, nếu chưa chắc chắn liệu LER có đang ảnh hưởng đến dữ liệu kiểm tra nội độc tố hay không, việc thực hiện nghiên cứu hold-time là cách duy nhất để xác nhận.

Tuy nhiên, việc thẩm định và thực hiện các nghiên cứu này ở mức độ tin cậy cao có thể là thách thức ngay cả đối với các phòng kiểm nghiệm Kiểm soát Chất lượng (QC). Một giải pháp là thuê các phòng thí nghiệm dịch vụ kiểm tra nội độc tố được công nhận UKAS để thực hiện nghiên cứu LER.

Tại Vương quốc Anh, Cotton Mouton Diagnostics hiện là trung tâm kiểm tra nội độc tố duy nhất được UKAS (ISO 17025) công nhận để thực hiện:

• nghiên cứu hold-time về LER
• nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp thử nội độc tố.

Nguồn tham khảo

1. United States Pharmacopeial Convention. (2024). United States Pharmacopeia – USP–NF 2024: Chapter <85> Bacterial Endotoxins Test. Rockville, MD: USP.
2. Center for Drug Evaluation and Research (2012). FDA Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing. Available at https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/guidance-industry-pyrogen-and-endotoxins-testing-questions-and-answers
3. Tsuchiya, M. (2021). Sample Treatments That Solve Low Endotoxin Recovery Issues. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 73(5): 433-442.
4. Bolden, J.S. et al. (2014). Evidence Against a Bacterial Endotoxin Masking Effect in Biologic Drug Products by Limulus Amebocyte Lysate Detection. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 68(5): 472-477.
5. BioPhorum Operations Group. (2024). It is time to reconsider the use of naturally occurring endotoxins in endotoxin recovery studies: Part 2 of a BioPhorum harmonized endotoxin recovery study. https://www.biophorum.com/news/it-is-time-to-reconsider-the-use-of-naturally-occurring-endotoxins-in-endotoxin-recovery-studies-part-2-of-a-biophorum-harmonized-endotoxin-recovery-study/
6. Reich, J., et al. (2019). Low Endotoxin Recovery—Masking of Naturally Occurring Endotoxin. International Journal of Molecular Sciences, 20(4): 838.
7. Petsch, D. & Anspach, F.B. (2000). Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology, 76(2–3): 97–119.
8. Rietschel, E.T., et al. (1994). Bacterial endotoxin: Molecular relationships of structure to activity. FASEB Journal, 8(2): 217–225.
9. Gorman, A. & Golovanov, A.P. (2022). Lipopolysaccharide Structure and the Phenomenon of Low Endotoxin Recovery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 180: 289–307.
10. Integra Lifesciences, FDA Warning letter MARCS-CMS 698850 19th Dec 2024