Mô tả
MLPA: Tiêu chuẩn vàng xác định số lượng bản sao DNA
Ứng dụng của kit MLPA: Phát triển hơn 400 bộ Probe khuếch đại trình tự đích ở các bệnh di truyền/ đột biến gen từ các bệnh phổ biến (Duchenne, DiGeorge syndrome, SMA) tới các bệnh hiếm gặp (hereditary pancreatitis, Antithrombin deficiency, Birt-Hogg-Dube syndrome).
– MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là một phương pháp chuyên dụng nhằm phát hiện số lượng bản sao bất thường lên đến 50 trình tự DNA bộ gen, có khả năng phân biệt các trình tự khác nhau chỉ với sự khác biệt một nucleotide.
– Kỹ thuật MLPA dễ sử dụng và có thể được thực hiện trong nhiều phòng thí nghiệm với máy PCR và điện di mao quản.
– Có thể phân tích đồng thời tới 96 mẫu và trả kết quả trong vòng 24 giờ.
_ Ưu điểm của kĩ thuật này nằm ở tính linh hoạt: MLPA có thể được sử dụng để phát hiện những thay đổi số lượng bản sao từ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh đến các exon đơn lẻ.
_ MLPA cũng được sử dụng để phát hiện các thay đổi methyl hóa DNA (MS-MLPA) và đủ nhạy để phân biệt các sai lệch trong gen gây bệnh với các giả gen cao giống nhau.
Nguyên lý cơ bản của phương pháp MLPA:
- Đoạn dò MLPA (MLPA probes): gắn đặc hiệu với các trình tự mục tiêu. Một đoạn dò (probe) của phương pháp MLPA bao gồm 2 phần: đoạn oligonucleotide phái bên trái (left probe oligonucleotide – LPO) và bên phải (right probe oligonucleotide – RPO). Trên các đoạn LPO và RPO có chứa trình tự mồi cho phản ứng PCR và trình tự lai DNA. Một đoạn trình tự sẽ được thêm vào phía bên đoạn RPO để khiến cho mỗi đoạn dò có một kích thước đặc biệt.
- Biến tính mẫu và lai các đoạn dò (Probe hybridisation): trong bước này mẫu chứa DNA đã được tinh sạch sẽ được biến tính; sau đó sẽ được ủ qua đêm với các đoạn dò oligo LPO và RPO.
- Phản ứng nối đoạn dò (Probe ligation): có độ đặc hiệu cao, không cho phép có sự sai lệch nào xung quanh vị trí nối xảy ra. Số lượng sản phẩm nối các đoạn dò là thước đo cho số lượng các trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu.
- Phản ứng khuếch đại đoạn dò (Probe amplification): trong giai đoạn này, chỉ các đoạn dò đã được nối lại sau phản ứng nối mới được khuếch đại.
- Phân tách các đoạn (Fragment separation): với hệ thống điện di mao quản, các sản phẩm PCR sẽ được phân tách dựa vào chiều dài khác nhau; mỗi sản phẩm PCR sẽ tượng trưng cho một đoạn dò MLPA đặc hiệu
- Phân tích kết quả (Data analysis) nhờ vào phần mềm Coffalyser.Net
Quy trình thực hiện của phương pháp MLPA: cũng được mô tả cụ thể trong đoạn video bên dưới.
* Phản ứng MLPA:
– Các Probes MLPA được lai vào các trình tự đích (55-80 nucleotide)
– Cặp Primer đơn mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại MLPA
– Kích thước sản phẩm khuếch đại: 130 – 500 nucleotide (phù hợp cho phân tích bằng điện di mao quản)
– Kỹ thuật MLPA phân tích methyl hóa: Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA)
Đoạn dò (Probe) cho MS-MLPA có thêm đoạn trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HhaI bên đoạn LPO
Dựa vào đặc tính nhạy cảm với vị trí DNA bị methyl hóa của enzyme HhaI. Hỗn hợp lai được chia thành 2 phản ứng:
+ Một phản ứng theo quy trình MLPA bình thường, không ủ enzyme HhaI.
+ Một phản ứng có thêm bước ủ với enzyme HhaI. HhaI sẽ cắt các hỗn hợp lai DNA bình thường, chỉ còn lại các hỗn hợp lai DNA methyl hóa, sau đó sẽ được khuếch đại thông qua phản ứng PCR.
* Cung cấp tùy theo nhu cầu sử dụng:
– Probe Mix: 25 rxn / 50 rxn / 100 rxn
– Reagent Kit: 100 rxn / 500rxn
Reagen Kit dùng chung cho tất cả các loại Probemix
– Enzyme HhaI (sử dụng cho phản ứng MS-MLPA)
Tham khảo: https://www.mrcholland.com/technology/mlpa
